U velenu di serpente cuntene enzimi chì idrolizzanu i ligami esteri carbossilici.I sustrati per l'idrolisi sò fosfolipidi, acetilcolina è acetate aromaticu.Questi enzimi includenu trè tippi: fosfolipasi, acetilcolinesterasi è esterasi aromatiche.L'esterasi di l'arginina in u velenu di serpente pò ancu idrolizà l'arginina sintetica o lisina, ma principarmenti idrolizza i ligami di peptidi di a proteina in natura, per quessa appartene à a proteasi.L'enzimi discututi quì agisce solu nantu à i sustrati esteri è ùn ponu micca agisce nantu à alcuna lea peptidica.Trà questi enzimi, e funzioni biologiche di acetilcolinesterasi è fosfolipasi sò più impurtanti è sò stati studiati.Certi veleni di serpente anu una forte attività di esterasi aromatica, chì ponu idrolizà p-nitrofenyl ethyl ester, a - o P-naphthalene acetate è indole ethyl ester.Hè ancu scunnisciutu s'ellu sta attività hè prodotta da una enzima indipendente o un effettu secundariu cunnisciutu di carboxylesterase, senza solu u so significatu biologicu.Quandu u velenu di Agkistrodon halys Japonicus hè statu reagitu cù p-nitrophenyl ethyl ester è indole ethyl ester, l'hydrolysates di p-nitrofenol è indole phenol ùn sò micca stati trovati;À u cuntrariu, se sti esteri reagiscenu cù cobra Zhoushan subspecies venom di serpente è Bungarus multicinctus venom di serpente, seranu rapidamente idrolizzati.Hè cunnisciutu chì questi veleni di cobra anu una forte attività di colinesterase, chì pò esse rispunsevuli di l'idrolisi di i sustrati sopra.In fatti, Mclean et al.(1971) hà dettu chì parechji veleni di serpente chì appartenenu à a famiglia di Cobra ponu hydrolyze indole ethyl ester, naphthalene ethyl ester è butyl naphthalene ester.Questi veleni di serpente venenu da: cobra, cobra à collu neru, cobra à labbra negra, cobra d'oru, cobra egiziana, cobra reale, mamba cobra d'oru, mamba nera è mamba à labbra biancu (D. aw cunnosci sempre u serpente à sonagli di rombola orientali).
U velenu di serpente pò hydrolyze metil indole ethyl ester, chì hè u sustrato per a determinazione di l'attività di colinesterase in u serum, ma stu velenu di serpente ùn mostra micca attività di colinesterasi.Questu mostra chì ci hè una esterase scunnisciuta in u velu di cobra, chì hè diversu da a colinesterasi.Per capiscenu a natura di questa enzima, hè necessariu un travagliu di separazione.
1, Fosfolipasi A2
(I) Panoramica
A fosfolipasi hè un enzima chì pò idrolizà fosfatatu di gliceril.Ci sò 5 tipi di fosfolipasi in natura, à dì a fosfolipasi A2 è a fosfolipasi.
A., fosfolipasi B, fosfolipasi C è fosfolipasi D. U velenu di serpente cuntene principalmente fosfolipasi A2 (PLA2), uni pochi di veleni di serpente cuntenenu fosfolipasi B, è altri fosfolipasi sò principarmenti truvati in tessuti animali è batteri.Fig. 3-11-4 mostra u situ di azzione di sti fosfolipasi nantu à l'idrolisi di sustrato.
Trà i fosfolipasi, PLA2 hè statu studiatu più.Pò esse l'enzima più studiata in u velenu di serpente.U so sustrato hè u ligame ester nantu à a seconda pusizioni di Sn-3-glycerophosphate.Questa enzima hè largamente truvata in velenu di serpente, velenu d'api, velenu di scorpione è tessuti animali, è PLA2 hè abbundante in quattru veleni di serpente famigliali.Perchè sta enzima rompe i globuli rossi è provoca l'emolisi, hè ancu chjamata "hemolysin".Certi pirsuni chjamanu ancu PLA2 lecitinasi emolitica.
Ludeeke hà scupertu prima chì u velenu di serpente pò pruduce un compostu hemoliticu agiscenu nantu à a lecitina per mezu di enzimi.In seguitu, Delezenne et al.pruvò chì quandu u velenu di cobra agisce nantu à u serum di cavallu o u vitellone, forma una sustanza emolitica.Avà hè cunnisciutu chì PLA2 pò agisce direttamente nantu à i fosfolipidi di a membrana di eritrociti, distrughjendu a struttura di a membrana di eritrociti è pruvucannu l'emolisi diretta;Puderà ancu agisce nantu à u serum o a lecitina aghjuntu per pruduce lecitina emolitica, chì agisce nantu à i globuli rossi per pruduce l'emolisi indiretta.Ancu s'ellu PLA2 hè abbundante in e quattru famiglie di velenu di serpente, u cuntenutu di l'enzimi in vari veleni di serpente hè pocu sfarente.Serpente à sonailles (C
U velenu di serpente mostrava solu una debule attività di PLA2.A Tabella 3-11-11 illustra a comparazione di l'attività PLA2 di 10 veleni maiò di serpenti velenosi in Cina.
Tabella 3-11-11 Paragone di l'attività di fosfolipasi VIII di 10 veleni di serpente in Cina
Venenu di serpente
Liberazione di grassu
l'acidu alifaticu,
Cjumol/mg)
Attività emolitica CHU50/^ g * ml)
Venenu di serpente
Rilascia l'acidi grassi
(^raol/mg)
Attività emolitica "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
ondeci
Micracephal ofis
cinque punti unu zero
kalyspallas
8. 68
duimila ottucentu
gracilis
V, acutus
7. 56
*** #
Ophiophagus Hannah
trè punti ottu dui
centu quaranta
Bnugarus fastatus
7,56
duicentu ottanta
B. multicinctus
unu puntu nove sei
duicentu ottanta
Viper à russelli
sette punti zero trè
T, mucrosquamatos
un puntu ottu cinque
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separazione è purificazione
U cuntenutu di PLA2 in u velenu di serpente hè grande, è hè stabile à u calore, à l'acidu, à l'alkali è à u denaturante, perchè hè faciule per purificà è separà PLA2.U metudu cumunu hè di fà prima a filtrazione di gel nantu à u velenu crudu, poi eseguisce a cromatografia di scambiu di ioni, è u prossimu passu pò esse ripetutu.Si deve esse nutatu chì a liofilamentu di PLA2 dopu a cromatografia di scambiu di ioni ùn deve micca pruvucà l'aggregazione, perchè u prucessu di liofilamentu spessu aumenta a forza ionica in u sistema, chì hè un fattore impurtante chì causa l'aggregazione di PLA2.In più di i metudi generale sopra, i metudi seguenti sò stati ancu aduttati: ① Wells et al.② L'analogue di sustrato di PLA2 hè stata utilizata cum'è ligand per a cromatografia di affinità.Stu ligandu pò ligà à PLA2 in u velenu di serpente cù Ca2+.L'EDTA hè principalmente utilizatu com'è eluente.Dopu chì Ca2+ hè sguassatu, l'affinità trà PLA2 è ligand diminuisce, è pò esse dissociatu da ligand.Altri utilizanu solu suluzione organica 30% o urea 6mol / L cum'è eluente.③ A cromatografia idrofobica hè stata eseguita cù PheiiylSephar0SeCL-4B per caccià a traccia di PLA2 in cardiotoxin.④ L'anticorpu anti PLA2 hè statu usatu cum'è ligand per fà a cromatografia di affinità nantu à PLA2.
Finu a ora, un gran numaru di velenu di serpente PLAZ sò stati purificati.Tu et al.(1977) hà listatu PLA2 purificatu da u velenu di serpente prima di 1975. In l'ultimi anni, un gran numaru d'articuli nantu à a separazione è a purificazione di PLA2 sò stati rappurtati ogni annu.Quì, ci focalizemu nantu à a separazione è a purificazione di PLA da studiosi chinesi.
Chen Yuancong et al.(1981) hà separatu trè spezie PLA2 da u velenu di Agkistrodon halys Pallas in Zhejiang, chì pò esse divisu in PLA2 acidicu, neutru è alkaline secondu i so punti isoelectric.Sicondu a so toxicità, u PLA2 neutru hè più tossicu, chì hè statu identificatu cum'è neurotoxin presinaptic Agkistrodotoxin.L'alkaline PLA2 hè menu tossicu, è u PLA2 acidicu ùn hà quasi nisuna toxicità.Wu Xiangfu et al.(1984) hà paragunatu e caratteristiche di trè PLA2, cumpresu u pesu molekulari, a cumpusizioni di aminoacidi, N-terminale, puntu isoelettricu, stabilità termale, attività enzimatica, toxicità è attività emolitica.I risultati anu dimustratu chì avianu un pesu moleculare è una stabilità termale simili, ma avianu differenzi significati in altri aspetti.In l'aspettu di l'attività enzyme, l'attività enzyme àcida era più altu ch'è l'attività enzyme alkaline;L'effettu emoliticu di l'enzyme alkaline nantu à i globuli rossi di u ratu era u più forte, seguitu da l'enzima neutru, è l'enzima acidu hè pocu hemolyzed.Dunque, hè speculatu chì l'effettu hemoliticu di PLAZ hè in relazione cù a carica di a molécula PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) anu fattu cristalli Agkistrodotoxin.Tu Guangliang et al.(1983) hà infurmatu chì un PLA tossicu cù un puntu isoelectric di 7. 6 hè statu isolatu è purificatu da u velenu di Vipera rotundus da Fujian, è e so proprietà fisiche è chimiche, a cumpusizioni d'aminoacidu è a sequenza di 22 residui d'aminoacidu à u N. -terminale sò stati determinati.Li Yuesheng et al.(1985) hà isolatu è purificatu un altru PLA2 da u velu di Viper rotundus in Fujian.A subunità di u PLA2 * hè 13 800, u puntu isoelectric hè 10,4, è l'attività specifica hè 35/xnioI/miri mg。 Cù lecitina cum'è sustrato, u pH ottimali di l'enzima hè 8,0 è a temperatura ottima hè 65 ° C. LD5 injected intravenously in topi.Hè 0,5 ± 0,12 mg / kg.Questa enzima hà evidenti effetti anticoagulanti è emolitici.A molécula PLA2 tossica hè custituita da 123 residui di 18 tipi di aminoacidi.A molécula hè ricca in cisteina (14), àcitu asparticu (14) è glicina (12), ma cuntene solu una metionina, è u so N-terminale hè residu di serina.Comparatu cù PLA2 isolatu da Tuguang, u pesu molekulari è u numeru di residui di aminoacidi di i dui isoenzimi sò assai simili, è a cumpusizioni di aminoacidi hè ancu assai simili, ma u numeru di residui di l'acidu asparticu è di proline hè un pocu sfarente.U velenu di serpente cobra King Guangxi cuntene PLA2 riccu.Shu Yuyan et al.(1989) hà isolatu un PLA2 da u velenu, chì hà una attività specifica 3.6 volte più altu ch'è u velenu originale, un pesu molekulari di 13000, una cumpusizioni di 122 residui aminoacidi, un puntu isoelectric di 8.9, è una bona stabilità termale.Da l'osservazione di u microscopiu elettronicu di l'effettu di u PLA2 basicu nantu à i globuli rossi, si pò vede chì hà un effettu evidenti nantu à a membrana di i globuli rossi umani, ma ùn hà micca un effettu evidenti nantu à i globuli rossi di capra.Stu PLA2 hà un effettu ritardatu evidenti nantu à a velocità elettroforetica di i globuli rossi in l'omu, capre, cunigli è porcellini d'India.Chen et al.Questa enzima pò inibisce l'aggregazione di piastrine indotta da l'ADP, u collagene è l'acidu arachidonicu di sodiu.Quandu a concentrazione di PLA2 hè 10/xg/ml~lOOjug/ml, l'aggregazione di piastrine hè completamente inibita.Se i platelets lavati sò stati usati com'è materiali, PLA2 ùn pudia micca impedisce l'aggregazione à a cuncentrazione di 20Mg/ml.L'aspirina hè un inhibitore di cyclooxygenase, chì pò inibisce l'effettu di PLA2 in platelets.PLA2 pò inibisce l'aggregazione di piastrine idrolizzandu l'acidu arachidonicu per sintetizà tromboxane A2.A cunfurmazione di suluzione di PLA2 prodotta da Agkistrodon halys Pallas venom in a pruvincia di Zhejiang hè stata studiata per mezu di dicroismu circular, fluoriscenza è absorption UV.I risultati spirimintali dimustranu chì a conformazione di a catena principale di sta enzima era simile à quella di u listessu tipu d'enzima da altre spezie è generi, a conformazione di u scheletru hà una bona resistenza à u calore, è u cambiamentu strutturale in l'ambiente acidu era reversibile.A cumminazzioni di l'attivatore Ca2 + è l'enzima ùn affetta micca l'ambiente di residui di triptofanu, mentri l'inhibitore Zn2 + faci u cuntrariu.A manera in quale u valore di pH di a suluzione affetta l'attività di l'enzima hè diversu da i reagenti sopra.
In u prucessu di purificazione PLA2 di velenu di serpente, un fenomenu evidenti hè chì un velenu di serpente cuntene dui o più picchi di eluzione PLA2.Stu fenominu pò esse spiegatu cusì: ① per l'esistenza di isozymes;② Un tipu di PLA2 hè polimerizatu in una varietà di mischie di PLA2 cù diversi pesi molecolari, a maiò parte di i quali sò in a gamma di 9 000 ~ 40 000;③ A cumminazzioni di PLA2 è altri cumpunenti di velenu di serpente complica PLA2;④ Perchè u legame amide in PLA2 hè idrolizatu, a carica cambia.① È ② sò cumuni, cù solu uni pochi eccezzioni, cum'è PLA2 in CrWa/w velenu di serpente
Ci sò dui situazioni: ① è ②.A terza cundizione hè stata trovata in PLA2 in u velenu di i serpenti seguenti: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, vipera palestiniana, vipera di sabbia è terribili serpenti à sonagli km.
U risultatu di u casu ④ cambia a velocità di migrazione di PLA2 durante l'elettroforesi, ma a cumpusizioni di aminoacidi ùn cambia micca.I peptidi ponu esse rotti da l'idrolisi, ma in generale sò sempre ligati da ligami disulfuri.U velenu di u rattlesnake di fossa orientale cuntene duie forme di PLA2, chjamati tipu a è tipu p PLA2 rispettivamente.A diferenza trà sti dui tipi di PLA2 hè solu un aminoacidu, vale à dì, a glutamina in una molécula PLA2 hè rimpiazzata da l'acidu glutamicu in l'altra molécula PLA2.Ancu s'è u mutivu esatta di sta diffarenza ùn hè micca chjaru, in generale si crede chì hè in relazione cù a deaminazione di PLA2.Se u PLA2 in u velenu di vipera palestinese hè tenutu caldu cù u velenu crudu, i gruppi finali in i so molécule d'enzimi diventeranu più cà prima.Da C PLA2 isolatu da u velenu di serpente hà dui N-terminali diffirenti, è u so pesu molekulari hè 30000. Stu fenominu pò esse causatu da u dimeru asimmetricu di PLA2, chì hè simili à u dimeru simmetricu furmatu da PLA2 in u velenu di rattlesnake orientali diamondback. è u serpente à sonagli di diamanti occidentali.U cobra asiaticu hè cumpostu di parechje sottuspezie, alcune di quali ùn sò micca assai definite in classificazione.Per esempiu, ciò chì si chjamava a sottuspecie Cobra Outer Caspian hè avà ricunnisciutu
Hè da esse attribuita à a Cobra di u Mar Caspiu Esternu.Siccomu ci sò parechje sottuspezie è sò mischiati, a cumpusizioni di u velenu di serpente varieghja assai per via di e diverse fonti, è u cuntenutu di l'isoenzimi PLA2 hè ancu altu.Per esempiu, u velenu di cobra
Almenu 9 tipi di isoenzimi PLA2 di spezie r ^ ll sò stati truvati in, è 7 tipi di isoenzimi PLA2 sò stati truvati in u velenu di a sottuspecie di cobra Caspian.Durkin et al.(1981) hà studiatu u cuntenutu di PLA2 è u nùmeru di isoenzimi in diversi veleni di serpente, cumprese 18 venoms cobra, 3 venoms mamba, 5 venoms viper, 16 venoms rattlesnake è 3 venoms di serpente di mare.In generale, l'attività PLA2 di u velenu di cobra hè alta, cù assai isoenzimi.L'attività PLA2 è l'isoenzimi di u velenu di vipera sò mediu.L'attività PLA2 di u velenu di mamba è u velenu di rattlesnake hè assai bassa o nisuna attività PLA2.L'attività PLA2 di u velenu di serpente di mare hè ancu bassa.
Nta l'ultimi anni, ùn hè micca statu infurmatu chì PLA2 in u velenu di serpente esiste in forma di dimer attivu, cum'è u rattlesnake orientali di rhombophora (C. venom di serpente cuntene u tipu a è u tipu P PLA2, chì sò cumposti da dui subunità idèntica). , è solu dimerase hà
Attività.Shen et al.prupostu ancu chì solu u dimeru di PLA2 di u velenu di serpente hè a forma attiva di l'enzima.U studiu di a struttura spaziale prova ancu chì PLA2 di u rattlesnake diamondback occidentale esiste in forma di dimer.Cumpostu piscivoru
Ci sò dui PLA ^ Ei è E2 diffirenti di velenu di serpente, in quale 仏 esiste in forma di dimeru, u dimeru hè attivu, è u so monomeru dissociatu hè inattivu.Lu Yinghua et al.(1980) hà studiatu ancu e proprietà fisiche è chimiche è a cinetica di reazzione di E. Jayanthi et al.(1989) isolanu un PLA2 basicu (VRVPL-V) da u velenu di vipera.U pesu moleculare di u monomeru PLA2 hè 10000, chì hà effetti letali, anticoagulanti è edema.L'enzima pò polimerizà polimeri cù diversi pesi moleculari sottu a cundizione di PH 4.8, è u gradu di polimerizazione è u pesu moleculare di i polimeri aumentanu cù l'aumentu di a temperatura.U pesu moleculare di u polimeru generatu à 96 ° C hè 53 100, è l'attività PLA2 di stu polimeru aumenta di dui.
Tempu di post: 18-novembre-2022